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小鼠基因型鉴定详解，必看！
问题一：
Q：鼠达人，实验室新引进新的基因工程小鼠，如何鉴定小鼠的基因型呢？
A：常用的小鼠基因型鉴定方法有：常规PCR鉴定，qPCR鉴定以及测序鉴定，每种鉴定方法都有各自的特点。
01 | 常规PCR鉴定
常规PCR是目前最常用的基因型鉴定方法。通过设计特异性引物扩增目标基因片段（可借助Primer-BLAST等软件设计并校验引物特异性），然后通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的条带大小差异来判断小鼠的基因型。
优势：操作简便、成本较低，适用于已知突变位点的基因分型，常见于大多数实验室。
局限性：无法检测未知变异，灵敏度较低。
02 | qPCR鉴定
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR, qPCR）是一种更为精准的基因型鉴定方法。它通过荧光信号（如SYBR Green或TaqMan探针）实时监测PCR扩增过程，不仅可以判断基因型，还能够通过荧光信号实现基因拷贝数的定量分析。
优势：灵敏度高、特异性强，支持定量分析。
局限性：依赖探针或优化条件，设备成本高，操作复杂度高于常规PCR。
03 | 测序鉴定
在特定研究场景中，测序鉴定（如Sanger测序或NGS）是必不可少的手段，如点突变模型小鼠的基因型验证，或基因编辑产生的微小缺失/插入突变（仅涉及数个碱基）。通过测序可以直接读取目标基因的碱基序列，从而精准判定基因型。
优势：结果更为准确可靠，可发现新突变。
局限性：成本高、数据分析复杂，耗时较长。
问题二：
Q：鼠达人，最常用的是常规PCR鉴定，那具体怎么操作呢？
A：已经准备好了，看这里。
01 | 样本准备
在基因型鉴定中，小鼠基因组DNA的制备是决定实验结果好坏的关键。根据经验，通常在小鼠断奶前后（约3周龄）采集组织用于基因组DNA提取，例如剪取尾尖或耳组织。
不建议在较大龄时剪趾取样，如果必须通过剪趾获取组织，应在小鼠出生后10–15天内完成，以同时起到标记编号作用。
注意：
① 鼠尾尾尖(2~3mm)，鼠耳约2~5mm2，脚趾1枚可获得的DNA量足够用于基因型鉴定。
② 剪组织的剪刀每剪完一次需用酒精棉擦拭，避免DNA交叉污染。
③ 避免组织样本带有血液（血液中的溶血产物或抑制剂可能干扰PCR扩增）。
④ 采样后若不立即进行样品消化，需保存于-20℃或更低温度，在消化前避免反复冻融。
02 | DNA提取
1) 将组织（鼠尾）剪碎置于离心管中，加入47 μL裂解液和3μL蛋白酶K(20 mg/mL)。
2) 充分振荡混匀且完全浸没样本后，离心管置于55℃烘箱孵育过夜（确保组织完全消化）。
3) 消化完成的样本，于PCR仪加热至99 ℃处理10 min以灭活蛋白酶K，随后冷却至室温或4℃。
4) 灭活完成的样本加130 μL的ddH2O以稀释DNA，随后混匀，2000 rpm离心1 min将消化剩余的毛发、骨头等固态杂质离心于管底，后续PCR试验取上清作为模板。
5) 提取的DNA产物可短期保存于4 ℃，长期保存可置于-20 ℃或更低温度，避免反复冻融。DNA样品的OD260/280在1.8-2.0之间。
注意：
① 需要充分裂解鼠尾，样本应消化至肉眼看不到颗粒为止。
② DNA模板浓度应控制在50-100ng/μL进行PCR。
03 | PCR扩增
以某双转基因小鼠的基因鉴定方案为例，在进行PCR扩增前，应先确定PCR反应体系和扩增程序。
注意：
设置对照Control非常重要，不仅可以帮我们快速鉴别基因型，还能验证PCR反应体系是否正常工作。建议在实验中同时设置：阴性对照（不加模板的反应，确保无污染产生假阳性）；阳性对照（含已知基因型的模板，确保引物和反应体系有效）。
04 | 凝胶电泳
1）配置凝胶：根据目标条带配置1%-3%的琼脂糖凝胶，将1g-3g琼脂糖溶于100mL TAE缓冲液，微波炉加热至琼脂糖融化（1min），加入10μL核酸染料（EB替代物），倒入电泳模板中，随后插入梳子，待冷凝后使用。
2）加样：向琼脂糖凝胶中加入适量的DNA，小孔建议加10μL，大孔建议加20μL，并根据目标条带大小选择合适的DNA marker加入凝胶中。
3）跑胶：电泳仪设置100V-120V电压，跑20-30min，以溴酚蓝迁移至胶长2/3处停止。
4）成像：使用凝胶成像系统观察，拍摄照片。
5）结果读取：根据胶图中DNA Marker比对目标条带大小，区分野生型、杂合子及纯合子，出具基因型鉴定结果报告。
注意：
① PCR产物可根据条带大小，选择不同浓度的凝胶进行电泳（200bp：3%；200-1,000bp：1.5%-2%；>1,000bp：1%），后续根据电泳结果进行基因型分析。
② 微波加热时避免暴沸，冷却至60°C再倒胶，减少气泡和孔隙不均。
问题三：
Q：鼠达人，PCR扩增后出现假阳性、假阴性、或者是非特异性条带，怎么解决呢？
A：这些情况在平常操作中，如果没有加以注意，很容易出现，针对此，整理出了以下解决措施供参考。
01 | 假阴性问题
①如果模板中存在微量抑制剂，可适当稀释DNA模板，降低杂质比例；
②重新纯化提取DNA模板（乙醇纯化去除小分子抑制剂、离心柱纯化去除蛋白质/多糖等）；
③及时电泳，避免扩增产物长时间存放室温或4°C冰箱导致降解。
02 | 假阳性问题
① 如果是实验过程中出现阳性污染，如试剂耗材污染，建议更换试剂，灭菌耗材；如气溶胶污染，建议UV照射操作环境。
② 如果不是污染造成的，建议重新设计引物进行检测，条带不小于500bp，避免靶序列或引物过短。
03 | 出现非特异性条带
非特异性扩增条带较弱时：
① 降低引物和聚合酶的用量，或者更换酶。
② 提高退火温度，或采用梯度PCR法来优化条件。
③ 降低循环次数，避免引物过多的非特异性结合。
④ 纯化模板或者稀释模版，避免非特异性物质或降解片段的干扰。
非特异性扩增条带较强（非特异性条带的亮度与目的条带几乎相当甚至更亮）时：
建议重新设计PCR引物或尝试使用touchdown PCR。
本期分享就到这里，我们下期再见~
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